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藥用輔料分析與質量控制 ——UHPLC/Q-TOF結合PolymerStudio 軟件進行吐溫降解產物的研究

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研究背景

近年來,由于輔料降解或輔料中含有的過氧化物活性雜質與 API 發生反應等造成藥物質量風險的報道出現增加的趨勢。吐溫(學名聚山梨酯),是脫水山梨醇聚氧乙烯與脂肪酸酯化后產生的一系列混合物,是常用的藥 用輔料,特別是在抗體等生物制劑中。已有很多文獻報道關于吐溫降解造成抗體制劑中形成可見異物或不溶性微粒的問題。


吐溫有兩個主要的降解通路:水解和氧化。吐溫水解通常表現為酯化產物尤其是高酯化產物的減少,低聚合度聚氧乙烯(POE)的增加、游離脂肪酸以及其它不完全水解產物的產生。吐溫的氧化降解常見于吐溫 80,因為油酸中不飽和雙鍵的存在,容易受到 pH 值和金屬離子等因素的影響發生氧化,產生羥基化物、環氧化物、過氧化物等一系列氧化產物。根據特定的降解產物來推測解吐溫的降解通路,并在藥物開發階段采取有針對性的控制策略對于藥物制劑開發和質量控制很重要。


安捷倫與科邁恩以及中國醫學科學院/協和醫學院藥物研究所合作建立了一套完整地針對吐溫組成成分及其降解雜質的精細表征,通過 UHPLC-6500 系列  Q-TOF MS 液質聯用儀,配合 PolymerStudio 聚合物分析軟件和專用數據庫,為制劑處 方篩選和工藝優化提供了有力武器。


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圖 1. 吐溫及其降解雜質的全面快速分析方案


吐溫水解

吐溫降解初期的表現之一是亞類成分發生明顯變化,這些變化通常由于吐溫的水解產生,pH 值和酯酶的存在可能導致或加速吐溫的水解,主要表現為高酯化成分減少、酯化度降低、聚氧乙烯(POE)等未酯化成分含量增加且聚合度降低等。


實驗測試了吐溫 20 在制劑酸性環境下不同時間點的精細組成變化情況:從未酯化區域看,聚氧乙烯(POE)、聚氧乙烯異脫水山梨醇(PI)和聚氧乙烯脫水山梨醇(PS)的相對含量明顯增加,并且隨反應時間延長而繼續升高,聚合度也有明顯降低(可能與聚氧乙烯水解有關)。從單酯含量看,辛酸單酯、癸酸單酯和月桂酸單酯的相對含量變化較小,肉豆蔻單酯、棕櫚單酯和油酸單酯的含量隨著反應時間延長而明顯降低。雙酯及更高酯化度的化合物,隨著反應時間延長,信號強度明顯減小甚至消失。


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圖 2. 吐溫 20 在酸性環境下不同時間點的 TIC


實驗同時考察了針對吐溫 80 的酯酶水解,觀察到了未酯化成分 POE、PI 和 PS 含量的增加,聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯(PSTO)和四油酸酯(PSEO)相對含量的明顯減少,并觀察到了(異)脫水山梨醇母核水解的產物。另外,除了精細組成的變化,吐溫水解直接表現為酯化度的降低,可以從 PolyPattern 軟件分析報告中直接讀出。本例中吐溫 80 經過酯酶水解后,平均酯化度從 1.57 降至 0.71,而平均聚合度變化較?。◤?21.38 微弱下降至 19.95),表明吐溫 80 的酯酶水解,以高酯化成分水解脫油酸為主,POE 鏈幾乎沒有水解。


吐溫的氧化降解及降解產物表征

吐溫 80 因其脂肪酸鏈存在不飽和雙鍵,在高溫、光照和金屬離子等影響下,可能發生一系列的氧化反應,生成脂肪酸鏈變化的氧化產物。中國醫學科學院/協和醫學院藥物研究所張金蘭老師課題組今年在 Anal. Chem. 上發表文章,詳細探討了吐溫 80 的 32 類 348 種氧化雜質,優化了 UHPLC-Q/TOF 結合 AIM(全離子 MS/MS,All Ions MS/MS)的表征技術,建立了保留時間-結構特征鑒別模型,將高分辨質譜信息、同位素分布、特征碎片離子及保留時間模型應用于吐溫 80 氧化產物的鑒定。


上述研究工作,已經同步寫入 PolymerStudio 軟件數據庫,用于吐溫 80 氧化產物的全面快速表征。下圖展示了某生物制劑中吐溫 80 氧化產物的相對含量分析,占比較高的氧化雜質分別為聚氧乙烯脫水山梨醇單羥基油酸酯(PSMH)、聚氧乙烯異脫水山梨醇單羥基油酸酯(PIMH)和聚氧乙烯異脫水山梨醇雙羥基油酸酯(PIDH)。


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圖 3. 某生物藥物中吐溫 80 各個亞類氧化雜質的相對含量


特殊降解產物及未知物鑒定

在強降解等特殊實驗中,我們可能觀察到一些未知降解產物。這時可以利用 Q-TOF 的未知物鑒定能力,通過準確質量和同位素信息,推測未知物的分子式,再結合二級質譜特征碎片信息,推測未知物可能的結構。下圖展示了在吐溫 80 的強降解實驗中,除了觀察到 POE 含量增加,聚合度降低,還出現了一系列 POE 的氧化產物,可以利用高分辨質譜信息推測其分子式及可能的結構。


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圖 4. 吐溫 80 強降解實驗后 POE/PS/PI 的對比(右圖)及推測的 POE 氧化產物的質譜信息(左圖)


結 語

安捷倫 UHPLC-6500 系列 Q-TOF 質譜結合 PolymerStudio 聚合物分析軟件,可以全面快速表征吐溫及其常見降解產物,一方面有利于揭示吐溫的降解途徑并探究其可能的降解原因,另一方面可以全面探討環境因素和存放時間等對吐溫降解的影響,為制劑開發、工藝優化以及產品質量控制提供了有力的武器。


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